配合双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么，什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光，通过物镜汇聚，由于双光子激发需要很高的光子密度，而物镜焦点处的光子密度是比较高的，所以只有在焦点处才能发生双光子激发，产生荧光，该点产生的荧光再穿过物镜，被光探头接收，从而能够达到逐点扫描的效果。双光子显微镜只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被发动，所以双光子成像更清晰。美国ultima双光子显微镜授权供应商
从双光子的原理和特点我们就可以明显的得出双光子的优点：☆穿透能力强：相对于紫外光，可见光和近红外光都具有更强的穿透能力，因而受生物组织散射的影响更小，解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题；☆高分辨率：由于双光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内；☆漂白区域小：由于激发只存在于交点处，所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象；☆荧光收集率高：与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器（共焦），这样就提高了对荧光的收集率，而收集率的提高直接导致图像对比度的提高。国外荧光双光子显微镜的成像视野双光子显微镜已成为较厚有生命体生物组织三维成像中不可或缺的工具。
光学显微镜和电子显微镜本质的区别在于，光学显微镜：用的是可见光电子显微镜：用的是高频电子射波有什么区别，在于一个基本的原理，光的衍射。。。光波是一个有趣的东西，其中有一项，如果物体的体积小于光的波长，光一般可以绕过去，不发生明显变化。也就是说，有这个物体和没这个物体，在这种情况下，光是不会发生明显改变的。可见光的波长（肉眼）：380～780纳米，也就是，如果比380纳米还要小的东西，用光学显微镜，无论你放大多少倍，也是看不见的。因为光绕过去了。。。光的衍射为了克服这个问题，科学家用波长更短的光去照射物体，也是就被观测物。比如10纳米级的光，这样，就能看到我们用肉眼无论如何都看不见的东西。这就是电子显微镜多说一句，光速是不变的。光速=频率×波长。波长越短，频率越大。。频率越大，光波的能量越大。这就是为什么电子显微镜的功率越大，能看到的东西越小。颜色取决于物体能反射光的波长的长短当你看到的物体小于较小可见光的波长，那它就是没有颜色的。。。因为颜色是肉眼对于可见光频率在大脑中的投影。。。。所以只能把他们统一变为黑白。。。没有颜色不是透明的意思，它们不是肉眼可见颜色的定义中包含的。
双光子的来源:飞秒激光的双光子吸收理论早在1931年就由诺贝尔奖获得者MariaGoeppertMayer提出，并在30年后因为激光而得到实验验证，但WinfriedDenk用了近30年才发明了双光子显微镜。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要理解非线性过程。双光子吸收相当于和频产生的非线性过程，需要极高的电场强度，电场取决于聚焦光斑的大小和激光脉冲宽度。聚焦光斑越小，脉冲宽度越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只与物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只有激光脉冲宽度。基于以上分析，能够输出高重复率(100MHz)的超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光已经成为双光子显微镜的标准激发光源。这再次显示了双光子显微镜的优势:双光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光强较低，无法激发，所以双光子成像更清晰。双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。
随着技术的发展，双光子显微镜的性能得到不断地优化，结合它的特点，大致可以分成深和活两个方面的提升。要想让激发激光进入更深的层面，大致可从两个方面入手，装置优化与标本改造。关于装置优化，我们可以把激光束变得更细，使能量更加集中，就能让激光穿透更深。关于标本，其中影响光传播的主要是物质吸收和散射，解决这个问题，我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡，使其中的物质（主要是脂质）被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解，进而让标本“透明度”提高。双光子显微镜不需要共聚焦细孔，提高了荧光检测效率。国内荧光双光子显微镜用途
双光子显微镜大量运营在实验室当中；美国ultima双光子显微镜授权供应商
TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纤激光器是一种易于操作且无需维护的激光系统。其输出波长为920nm，非常适合常规荧光基团（如GFP，eGFP，Eosin，GCaMP，CFP，Calcein或者Venus）的双光子激发。能给荧光基团提供比较高的峰值功率，常用于神经科学和其他与激光有关的生物光子学学科。而且其独特设计（制造简单且经济高效的光源）对双光子荧光显微镜发展的革新具有潜在的可能。在双光子显微镜中，峰值功率就是亮度！如果您希望获得比较好的图像亮度，那么你就需要短脉冲，高功率，较重要的是需要干净的时间脉冲形状。FemtoFiberultra920具有足够高的输出功率，较短的脉冲和独特的Clean-Pulse技术，以及具有相对比较高的峰值功率，使得其在双光子显微镜中可以实现****的亮度，而不会对样品造成不必要的加热。FemtoFiberultra920交钥匙，完全集成的色散补偿（可确保样品处的脉冲较短），内置的功率控制，操作直观以及其坚固而紧凑的设计，使该系统具有极为友好的用户体验，是非线性显微镜应用的较好解决方案。例如荧光蛋白的双光子激发和基于SHG的对比机制。美国ultima双光子显微镜授权供应商
