细胞经诱导或阻止后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有:观察自噬体的形成。由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。自噬可以清理掉磨损的细胞,并进行更换,从而使细胞衰老的时间延长。西安自噬流
对抗关系中,自噬与凋亡的目标及过程背道而驰。自噬并不引发细胞死亡,相反促进细胞存活。内质网应激中,自噬通过消化蛋白聚集物和错误折叠蛋白维护内质网功能,限制了内质网应激反应诱发的细胞凋亡。在细胞能量危机的时候,自噬还通过消化细胞器和蛋白质等大分子为细胞提供能量和营养,延长细胞寿命。因而在成年小鼠的饥饿期、乳鼠出生后的喂养适应期以及营养剥夺的细胞中,均显示出自噬为细胞存活所必需[11]。在细胞遭受代谢应激、药物调整和放射性损伤时,自噬也是维护基因完整性的重要机制。因此,在乳腺病、前列腺病及结肠病细胞中阻止自噬,能够提高病变细胞对放化疗的敏感性。线粒体自噬是自噬的一种,它能通过清理去极化线粒体减少活性氧簇,达到细胞保护的目的。线粒体自噬甚至可通过减少线粒体外膜通透化(mitochondrialoutermembranepermeabilization,MOMP)和减少细胞色素C和SMAC/DIABLO等线粒体促凋亡蛋白的释放阻止凋亡发生。河南细胞自噬电镜检测疫苗是预防肝病发生比较经济有效的方式,疫苗都与自噬关系密切。
在心力衰竭早期,线粒体自噬往往被抑制,此时如果适当提高线粒体自噬水平,可以延缓心力衰竭的进展;而在心力衰竭晚期,线粒体自噬往往被过度激huo,导致心肌细胞功能障碍,心力衰竭加重,此时应适当抑制线粒体自噬水平。Milonas等研究发现,心力衰竭患者的心肌细胞中Beclin-1和LC3表达增加,而随着心脏负荷减轻,Beclin-1和LC3表达亦随之降低,提示线粒体自噬与心力衰竭有关。Givvimani等在构建压力负荷诱导的心力衰竭模型的实验中发现,随着线粒体自噬水平异常增强,细胞凋亡也异常增加。
自噬(Autophagy),即细胞“吃掉自己”的过程,是一种细胞自我降解和循环利用胞内组分的过程。常见的自噬过程有三种类型:巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。在现代的生物学中,“自噬”的概念是由比利时生物化学家克里斯汀·德·迪夫(ChristiandeDuve)在研究溶酶体功能时首先提出的。尽管克里斯汀·德·迪夫因发现和阐明溶酶体的功能获得了1974年诺贝尔生理和医学奖,细胞自噬的具体机理直到20世纪90年代才由日本生物学家大隅良典(YoshinoriOhsumi)阐明。大隅良典也因对细胞自噬的研究获得了2016年诺贝尔生理和医学奖。自噬在细菌与病原体入侵时产生的免疫防御中起到关键作用。
根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同,自噬分为以下几种。①大自噬:由内质网、高尔基体或细胞质膜等来源的膜包绕待降解物形成自噬体,然后与溶酶体融合并降解其内容物;②小自噬:溶酶体的膜直接包裹长寿命蛋白等,并在溶酶体内降解;③分子伴侣介导的自噬(chaperonemediatedautophagy,CMA):胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中,然后被溶酶体酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白质分子,在清理蛋白质时有选择性,而前两者无明显的选择性。在乳腺病、前列腺病及结肠病细胞中阻止自噬,能够提高病变细胞对放化疗的敏感性。青岛单荧光自噬
在用GFP-LC3B慢病毒感染细胞后,在非自噬的情况下,荧光显微镜下GFP-LC3B以弥散的形式存在于细胞质中;西安自噬流
柴胡中提取的单体成分柴胡皂苷d通过增加细胞质游离Ca2+浓度,激huoCaMKK[1]AMPK-mTOR通路诱导MCF-7细胞自噬性死亡。 另外,有学者报道,人参皂苷F2诱导乳腺ai干细胞CSC凋亡,且通过增加Atg7、Beclin-1、LC3B蛋白的量,增加LC3-GFP荧光蛋白和自噬泡诱导自噬,联合自噬抑制剂则能增强人参皂苷F2诱导的细胞凋亡。白藜芦醇诱导MDA-MB231细胞凋亡,增加LC3-II蛋白的量诱导自噬,但联合自噬抑制剂可增强白藜芦醇诱导MDA-MB231细胞凋亡。研究发现,β-榄香烯处理MGC-803和SGC[1]7901细胞可观察到LC3点状聚集、LC3-II蛋白水平增加、Atg5-Atg12相关蛋白上调,并且PI3K/Akt/ mTOR/p70S6K1通路受抑制,表明β-榄香烯可诱导胃ai细胞自噬,其机制可能与PI3K/Akt/mTOR/ p70S6K1通路相关。西安自噬流
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