单光子激发荧光的过程，就是荧光分子吸收一个光子，从基态跃迁到激发态，跃迁以后，能量较大的激发态分子，通过内转换把部分能量转移给周围的分子，自己回到比较低电子激发态的比较低振动能级。处于比较低电子激发态的比较低振动能级的分子的平均寿命大约在10s左右。这时它不是通过内转换的方式来消耗能量，回到基态，而是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个不同的振动能级时，就发射荧光。因为在发射荧光以前已经有一部分能量被消耗，所以发射的荧光的能量要比吸收的能量小，也就是荧光的特征波长要比吸收的特征波长来的长。由于其非侵入性和高分辨率的特点，多光子显微镜在神经科学、ai症研究、免疫学等领域发挥了重要作用。飞秒激光多光子显微镜
从产品类型及技术方面来看，正置显微镜占据绝大多数市场。2020年，全球多光子激光扫描正置显微镜市场达到87.30百万美元，预计到2027年该部分市场将达到154.02百万美元，年复合增长率（2021-2027）为8.48%。中国多光子激光扫描正置显微镜市场达到13.32百万美元，预计到2027年该部分市场将达到25.21百万美元，年复合增长率（2021-2027）为9.58%。从产品市场应用情况来看，研究机构为主要应用领域，2020年约占全球市场46.28%。2020年，全球多光子激光扫描显微镜研究机构应用消费量为174台，预计2027年达到349台，2021-2027年复合增长率（CAGR）为9.72%。美国进口多光子显微镜配置使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。
多光子成像系统提供的优势包括了真正的三维成像、对活组织内部深处进行成像的能力以及消除平面外荧光的能力。使用这种方法进行成像，可以对斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的荧光染料进行成像，甚至可以对样品或组织中固有的荧光分子进行成像。多光子成像的缺点包括需要高峰值功率脉冲激光器，例如锁模钛：蓝宝石激光器，并且直到现在，缺乏在整个发射范围内提供足够吞吐量的高性能滤光片。整个激光调谐范围内的兴趣和足够的阻挡。
多光子激发扫描显微成像系统的不足。只能对荧光成像。如果样品包括能够吸收激发光的色团，如色素，样品可能受到热损伤。分辨率略有降低，虽然可以通过同时利用共焦的小孔得到改善，但是信号会有损耗。受昂贵的超快激光器限制，多光子扫描显微镜的成本较高。多光子激发显微镜应用举例。动物和脑片神经细胞结构与功能、动物脑皮层的成像、胚胎发育过程的长时间动态观测、多光子激发光解笼、细胞内微区钙动力学、多光子激发自发荧光、其它应用。多光子显微镜的分辨率比传统的单光子共聚焦要低的多。
对于两个远距离(相距1-2mm以上)的成像部位，通常采用两个**的路径进行成像；对于相邻区域，通常使用单个物镜的多个光束进行成像。多光束扫描技术必须特别注意激发光束之间的串扰，这可以通过事后光源分离或时空复用来解决。事后光源分离法是指分离光束以消除串扰的算法；时空复用法是指同时使用多个激发光束，每个光束的脉冲在时间上被延迟，使不同光束激发的单个荧光信号可以暂时分离。引入的光束越多，可以成像的神经元越多，但多束会导致荧光衰减时间重叠增加，从而限制了分辨信号源的能力；并且复用对电子设备的工作速度要求很高；大量的光束也需要较高的激光功率来维持单束的信噪比，这样容易导致组织损伤。光子显微镜可以观察生物细胞、组织、微生物、纤维等样品，具有分辨率高、成像速度快、操作简单等优点。进口多光子显微镜数据分析
多光子显微镜是一款针对厚样本进行深层成像的利器,特别是在实验中。飞秒激光多光子显微镜
双光子荧光显微成像主要有以下优点∶a.光损伤小∶双光子荧光显微镜使用可见光或近红外光作为激发光，对细胞和组织的光损伤很小，适合于长时间的研究;b.穿透能力强∶相对于紫外光，可见光或近红外光具有很强的穿透性，可以对生物样品进行深层次的研究;c．高分辨率∶由于双光子吸收截面很小P，只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光，双光子吸收局限于焦点处的体积约为λ范围内;d.漂白区域很小，焦点以外不发生漂白现象。e．荧光收集率高。与共聚焦成像相比，双光子成像不需要光学滤波器，提高了荧光收集率。收集效率提高直接导致图像对比度提高。f.对探测光路的要求低。由于激发光与发射荧光的波长差值加大以及自发的三维滤波效果，多光子显微镜对光路收集系统的要求比单光子共焦显微镜低得多，光学系统相对简单。g.适合多标记复合测量。许多染料荧光探针的多光子激发光谱要比单光子激发谱宽阔，这样，可以利用单一波长的激发光同时激发多种染料，从而得到同一生命现象中的不同信息，便于相互对照、补充。飞秒激光多光子显微镜
