通过添加FACED模块,可以将基于标准振镜的现有2PM轻松转换为千赫兹成像系统。FACED双光子荧光显微镜遵循光栅扫描,需要很少的计算处理,在稀疏或密集的标记样本中均可以使用,并且不受串扰的影响,而且对整个图像平面采样后可以进行运动校正。实验中没有观察到光损伤的迹象,此外,子脉冲延迟到达相同的样品位置,能为荧光团提供充足的时间使其从易于破坏的暗态返回到基态,可以明显减少光漂白。使用现有的传感器,FACED双光子荧光显微镜可以提供足够的速度和灵敏度来检测神经元过程中的钙瞬变和谷氨酸瞬变,以及来自细胞体的尖峰和亚阈值电压。该组使用基于FACED的2PM显微镜,在小鼠大脑中实现了千赫兹速率的神经活动成像。在物镜平均激光功率为10-85mW下,他们测量了清醒小鼠中V1神经元的自发性和感觉诱发性的超阈值和亚阈值电位活动。高精度,低光损,多光子显微镜为科研提供准确依据。美国布鲁克多光子显微镜原理
单束扫描技术可以高速遍历大视场(FOV)的神经组织:使用MPM对神经元进行成像时,通过随机访问扫描—即激光束在整个视场上的任意选定点上进行快速扫描—可以只扫描感兴趣的神经元,这样不仅避免扫描到任何未标记的神经纤维,还可以优化激光束的扫描时间。随机访问扫描(图1)可以通过声光偏转器(AOD)来实现,其原理是将具有一个射频信号的压电传感器粘在合适的晶体上,所产生的声波引起周期性的折射率光栅,激光束通过光栅时发生衍射。通过射频电信号调控声波的强度和频率从而可以改变衍射光的强度和方向,这样使用1个AOD就可以实现一维横向的任意点扫描,利用1对AOD,结合其他轴向扫描技术可实现3D的随机访问扫描。但是该技术对样本的运动很敏感,易出现运动伪影。目前,快速光栅扫描即在FOV中进行逐行扫描,由于利用算法可以轻松解决运动伪影而被普遍的使用。灵长类多光子显微镜多光子显微镜可以更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。
现代分子生物学技术的迅速发展和科技的进步,特别是随着后基因组时代的到来,人们已经能够根据需要建立各种细胞模型,为在体研究基因表达规律、分子间的相互作用、细胞的增殖、细胞信号转导、诱导分化、细胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物学条件。然而,尽管人们利用现有的分子生物学方法,已经对基因表达和蛋白质之间的相互作用进行了深入、细致的研究,但仍然不能实现对蛋白质和基因活动的实时、动态监测。在细胞的生理过程中,基因、尤其是蛋白质的表达、修饰和相万作用往往发生可逆的、动态的变化。目前的分子生物学方法还不能捕获到蛋白质和基因的这些变化,但获取这些信息对与研究基因的表达和蛋白质之间的相互作用又至关重要。因此,发展能用于、动态、实时、连续监测蛋白质和基因活动的方法是非常必要的。
国内显微镜制造市场目前断层严重。目前我国显微镜行业发展缺乏技术沉淀,20年以上经营积累的企业十分稀缺,深度精密制造、光学主要部件设计及工艺严重制约产业升级。目前中国显微镜中如多光子显微镜、共聚焦扫描和电子显微镜等主要集中在徕卡显微系统、蔡司、尼康、奥林巴斯等国外企业。国内具备生产显微镜能力的企业屈指可数,若国内显微镜企业能打破技术壁垒,切入显微镜市场,企业的生产经营将腾跃至一个更高的格局。未来国产多光子激光扫描显微镜替代空间大。目前中国使用的多光子激光扫描显微镜几乎被徕卡显微系统、蔡司、尼康和奥林巴斯垄断。国内有能力开始生产多光子激光扫描显微镜的企业极少,若国内能够制造出高性能、高可靠性的多光子激光扫描显微镜,无异是会面临极大的市场机遇。利用多光子显微镜的多点光ji活能力,我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制。
在多光子显微镜(也称为非线性或双光子显微镜)中,以两倍正常激发波长照射样品。更长的波长是有利的,因为它们可以更深地穿透样品进行3D成像,并且因为它们不会损坏样品,从而延长样品寿命。为了实现多光子激发,照明光束在空间上聚焦(使用光学器件),同时使用高能短脉冲激发光束以提高两个(或更多)光子同时到达同一位置(即荧光团分子)的概率。多光子显微技术的例子包括二次谐波产生(SHG)、三次谐波产生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)和受激发射耗尽(STED)显微技术。由于这些技术中的每一种都使用脉冲激光器,因此选择能够比较大限度地减少脉冲色散的光学组件很重要,并且激光反射二向色镜应具有低GDD特性。多光子显微镜在临床前评价IA形态、细胞外基质、细胞密度和血管形成等方面显示出强大的作用。模块化多光子显微镜峰值功率密度
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快速光栅扫描有多种实现方式,使用振镜进行快速2D扫描,将振镜和可调电动透镜结合在一起进行快速3D扫描,但可调电动透镜由于机械惯性的限制在轴向无法快速进行焦点切换,影响成像速度,现可使用空间光调制器(SLM)代替。远程聚焦也是一种实现3D成像的手段,如图2所示。在LSU模块中,扫描振镜进行横向扫描,ASU模块包括物镜L1和反射镜M,通过调控M的位置实现轴向扫描。该技术不仅可以校正主物镜L2引入的光学像差,还可以进行快速的轴向扫描。想要获得更多神经元成像,可以通过调整显微镜的物镜设计来扩大FOV,但是具有大NA和大FOV的物镜通常重量较大,无法快速移动以进行快速轴向扫描,因此大型FOV系统需要依赖于远程聚焦、SLM和可调电动透镜。美国布鲁克多光子显微镜原理