外泌体分离方法

妊娠期间胎盘可释放外泌体到全身循环系统，参与妊娠期间母胎界面的免疫调节、子宫螺旋动脉重塑和胎盘屏障的形成等重要事件调控，在正常妊娠过程维持中发挥重要作用。而很多妊娠并发症，如子痫前期等胎盘功能紊乱相关疾病的发生，很可能与胎盘来源外泌体异常密切相关。目前外泌体分离方法主要包括：多步差速离心、蔗糖密度梯度离心、试剂盒沉淀、免疫磁珠分选、色谱法、过滤离心等方法。其中，多步差速离心是制备外泌体的经典方法，该方法是根据外泌体的沉降系数差速离心将其分离出来，然而妊娠期母血清中除含有胎盘组织释放的外泌体，还包括许多其他种类细胞释放的外泌体，如树突状细胞、淋巴细胞等，且血清中可能还存在一些大小类似的物质混杂其中，这些因素都会影响胎盘来源外泌体的分离纯化。外泌体本身的惰性相当高，但它们与细胞膜融合可将所携带的物质和信号传递到受体细胞并改变其生物学功能。外泌体分离方法

外泌体在心脏修复中起着关键作用。外泌体通过内含的miRNA直接调控基因表达，将信息传递给靶细胞。尽管干细胞移植治理是一种很有前景的修复损伤心脏组织并使其再生的辅助手段，但由于缺血心脏中移植细胞的存活状况不佳，一般只能观察到心脏功能的轻度改善。近期的研究表明，干细胞释放的外泌体可以作为心脏修复潜在的无细胞治理剂。干细胞分泌的外泌体相比干细胞有如下优点：（1）旁分泌效应，外泌体作为干细胞旁分泌作用的一种媒介；（2）组合起效，外泌体可与现有的组合物或方法进行组合；（3）个性化，外泌体可改造特定活性成分；（4）靶向特异性，外泌体被工程化改造后，具有靶向特定细胞类型或组织的功能；（5）安全性高，外泌体治理属于无细胞疗法。血清肌酐与外泌体症状细胞来源的外泌体含有与症状进展相关的分子。

研究者利用电穿孔法对外泌体进行DOX的负载，进行体内抗中流效果的研究。实验结果显示，负载DOX的iRGD肽靶向性外泌体对中流的抑制效果远优于单纯的DOX。直接静脉注射DOX，其不仅水溶性低，而且容易使DOX与血液中的蛋白结合，从而被网状内皮系统识别捕获，起不到理想的抗中流效果。而用iRGD肽靶向性的外泌体保护DOX，可以提高DOX水溶性，避免被网状内皮系统捕捉，提高靶向性，从而降低由于用药过量和非靶向性引起的毒性，起到更好的抗中流效果。

Vlassov等人发表的一篇外泌体的提取方法及组成的专利文献中介绍，通过终浓度为8%的PEG6000与生物体液共孵育14h后，10000xg离心1h，可将直径在30-150nm之间，且包含丰富RNA的外泌体沉淀下来。因此采用终浓度为8%的PEG6000沉淀血清中的外泌体，为了进一步纯化胎盘相关外泌体，将获得的包含外泌体的沉淀用PBS重新悬浮后，加入非线性蔗糖密度梯度层，10000xg超速离心5h，将分层液采用PEG6000进行2次沉淀。经过多次实验反复验证，确定同时表达外泌体标志蛋白分子及胎盘特异性蛋白分子的胎盘来源外泌体所在密度层。细胞表面受体表达不同，外泌体对受体细胞的影响可能不同，可能诱导细胞存活，也可能诱导凋亡或免疫调节等。

虽然系统递送的外泌体主要在肝脏、肾脏和脾脏中积累，但通过在外泌体的外表面上展示特定的靶向分子。例如，识别靶抗原的肽或抗体片段，可以获得靶向外泌体；通过在细胞分泌囊泡上展示糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的纳米抗体，可以使细胞分泌囊泡显示多种蛋白，包括抗体、荧光蛋白和信号分子。自然分泌的外泌体分离纯化直接作为药物的潜力有限，但是，将自然的外泌体分泌所需组分掺入合成脂质体或纳米颗粒中，并且使用可控程序组装后的工程化外泌体模拟物在药学上拥有更大的应用潜力。外泌体作为脑内种瘤和神经退行性疾病的新型标记物。辽宁CD63外泌体慢病毒

外泌体并作为症状早期诊断技术，应用于与症状进展相关的研究。外泌体分离方法

事实上，动物实验表明：在小鼠急性心肌梗塞术后，注射来源于间充质干细胞、心脏祖细胞、胚胎干细胞或心肌源性细胞的外泌体均可改善心脏功能，减轻心脏纤维化，刺激血管生成。例如，心源性细胞外泌体能通过特异性的巨噬细胞极化为急性心肌梗死提供心脏保护作用。心脏再灌注后，CDCexo的输注降低了大鼠和猪心肌梗死模型的梗死面积，而且CDCexo会减少梗死组织内CD68+巨噬细胞数量，并改变巨噬细胞的极化状态。自体CD34+干细胞的移植可以改善缺血组织再灌注后的功能，并降低严重肢体缺血患者的截肢率。其作用机制在于：CD34+干细胞分泌的外泌体促进小鼠下肢缺血模型血管生成。虽然临床前研究的证据表明干细胞释放的外泌体可以作为心肌修复的潜在无细胞治理剂，但是，目前将外泌体完全用作心脏修复治理剂之前还是有很多重点问题需要解决。外泌体分离方法

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