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磷酸化蛋白的WB第三方检测在实操过程中有哪些注意事项？细节决定成败，在科研中更是如此。1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。2.加一抗后比较好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。二抗则室温1小时即可。3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。务必找专业的磷酸化抗体公司订购。4.比较好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。5.抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。

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“做miRNA下调，QPCR检测miRNA，表达水平无变化”如何解决呢？反义核酸是在转录后水平发挥功能，要阻断miRNA的产生，理想情况是在生成成熟的miRNA之前阻断。此要求目前唯有CRISPR / Cas9能实现，Cas9通过在pre-miRNA序列中引入突变，从而破坏miRNA表达，是miRNA基因功能缺失研究的一种新方法。福建肖老师运用Cas9技术，针对miR-21基因设计sgRNA ，通过慢病毒递送细胞，并在RNA水平检测到mir-21的下调表达，从而研究出miR-21耗竭对CNE2鼻咽（NPC）细胞生物学特性及其潜在机制的影响。使用Cas9敲除miR-21之后，功能上也呈现出阳性，此外，温医大医院的张老师使用Cas9敲除mir-545，研究了人环状RNA PRKCI（circPRKCI）通过抑制miR-545显示致性，促进人类神经胶质瘤细胞的病理进展3。所以，CRISPR / Cas9对于miRNA的KO是有效的、被认可的、且以QPCR检测表达量完全没有问题。第三方检测QPCR实验就找成都瑞普信！贵州ELISA第三方检测机构

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