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磷酸化蛋白的WB第三方检测在实操过程中有哪些注意事项？研究完某一蛋白的磷酸化情况后比较好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完 phospho-p38 抗体后，我会把相同的 membrane 做 strip 后再压 p38, 然后再 strip 一次，再压内标 actin 。做磷酸化蛋白 WB 时，除了目标蛋白的 band 以外，往往会出现非特异性的 band. 磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的 band, 而没有你想要的 band, 所以压片以后，一定要根据 markers 比对一下，压出的 band 分子量是否正确。 磷酸化蛋白 WB 时 backgroud 也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则 backgroud 太深盖住想要的那条 band, 时间过短则可能没有 band 或者 band 太浅。磷酸化蛋白 WB 时，要用TBST，不能用PBST。用 TBST 洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗 5min 3 次即可，宁愿 background 深一些，总比做不出来强得多 . 另外，洗的时候，比较好不要把几张 membrane 叠在一起洗。

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磷酸化蛋白的WB第三方检测在实操过程中有哪些注意事项？“研究完某一蛋白的磷酸化情况后比较好也要研究一下该蛋白总的表达量 ”。这有两种方法，一是：相同的 sample 在不同的 well 中上样两次，可在相同的gel上，也可在不同的gel。其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个 gel ，压内标。但是本人不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，本人也建议如此的方法，即：将原先结合上的磷酸化抗体及二抗用 strip solution 洗去。瑞普信生物技术有限公司专做第三方检测ELISA实验靠谱吗？陕西免疫荧光抗体第三方检测机构

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在做第三方检测时为什么主带之外有时会出现杂带？导致杂带出现的可能原因包括：抗体特异性不足，目的蛋白存在不同修饰状态或有剪切降解形式，一抗或二抗使用过量，蛋白上样量过大，曝光时间过长，膜漂洗不充分，等原因。通过条件优化尽量减少杂带出现，但当抗体或样品特性造成少量杂带存在时，只要不影响主目的条带判别并不影响数据图片的应用。为什么有时胶片会出现明显较深的背景？在通过条件优化排除诸如封闭不充分、样品中存在杂质、抗体过量、漂洗不充分等实验原因之外，当特异性识别的目的条带信号太弱时，为了显示出目的条带而不得不延长曝光时间，随之使得背景变脏，此时关键点在于整个反应的“性噪比”太低，比较好换用特异性、亲和力更佳的一抗。贵州耗材第三方检测中心

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